實驗結果不理想，就是因為你忽視了這一步
實驗結果不理想，就是因為你忽視了這一步
ELISA實驗操(cao)作雖然很簡單，
但(dan)有時你辛辛苦苦做出的結果并(bing)不理想！
大多(duo)時是因(yin)為忽視(shi)了這一步(bu)？！··· ···
上重點 ！
優化ELISA的(de)重點(dian)之一(yi)在(zai)于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留，在*后一步產生信號。而不充分的洗滌會導致差異和高背景，從而帶來不理想的結果。
在做ELISA實驗時，洗板有兩種方法：手工法洗板和洗板機洗板。二者沒有本質的差別，只要操作合乎要求，均能得到正確、可靠的結果。
手工洗(xi)板人為因素比較大(da)(da)，實驗人員必須經驗豐富，洗(xi)滌次數(shu)要(yao)足夠，沖(chong)擊力又不(bu)要(yao)太(tai)大(da)(da)，加入(ru)的洗(xi)液量以(yi)剛滿反應孔(kong)為限，防止孔(kong)口內有(you)游離酶未能洗(xi)凈，同時(shi)防止孔(kong)與孔(kong)之(zhi)間液體交叉。洗(xi)滌結束后扣(kou)干(gan)(gan)亦非常重(zhong)要(yao)，否則易造成假(jia)陽(yang)性。每次洗(xi)完板后，在吸水紙上輕輕拍干(gan)(gan)，拍板時(shi)要(yao)垂(chui)直，避免交叉感(gan)染。用(yong)力不(bu)能過猛，防止抗(kang)原抗(kang)體復(fu)合物脫離;吸水紙要(yao)一次性使(shi)用(yong)，應使(shi)用(yong)不(bu)易脫落(luo)碎(sui)屑(xie)的吸水紙為宜。酶結合物不(bu)耐(nai)干(gan)(gan)燥(zao)，特別(bie)在較高的溫度(du)下更易失(shi)活，所以(yi)拍干(gan)(gan)的反應板應盡量縮短在空氣中暴(bao)露的時(shi)間，時(shi)間越長，吸光度(du)值越低(di)。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
1.吸干或甩干孔內反應(ying)液(ye)；
2.用(yong)洗滌液(ye)過洗一遍（將洗滌液(ye)注滿(man)板(ban)孔后，即甩去）；
3.浸(jin)泡，即將洗滌液注滿板(ban)孔，放置1～2分鐘，間(jian)歇搖動，浸(jin)泡時間(jian)不可(ke)隨意縮短(duan)；
4.吸干孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)(ti)。吸干應徹底，可用水(shui)泵或(huo)真(zhen)空泵抽吸，也可甩去液(ye)體(ti)(ti)后在清潔毛巾(jin)或(huo)吸水(shui)紙(zhi)上拍干；
5.重(zhong)復操作步驟3和4，洗(xi)滌(di)(di)3～4次(ci)(ci)（或按說明規定）。在間接法中如(ru)本底較高，可增加洗(xi)滌(di)(di)次(ci)(ci)數或延(yan)長(chang)浸泡(pao)時間。
微量(liang)滴定板多采用(yong)浸泡式(shi)洗(xi)滌(di)法。洗(xi)滌(di)液多為含非離子(zi)(zi)型(xing)洗(xi)滌(di)劑(ji)的中性緩沖液。聚苯乙(yi)烯載(zai)體(ti)與蛋白質(zhi)的結(jie)(jie)(jie)合(he)是(shi)疏水(shui)性的，非離子(zi)(zi)型(xing)洗(xi)滌(di)劑(ji)既含疏水(shui)基團(tuan)，也含親水(shui)基團(tuan)，其(qi)疏水(shui)基團(tuan)與蛋白質(zhi)的疏水(shui)基團(tuan)借疏水(shui)鍵結(jie)(jie)(jie)合(he)，從而削弱蛋白質(zhi)與固相載(zai)體(ti)的結(jie)(jie)(jie)合(he)，并(bing)借助(zhu)于親水(shui)基團(tuan)和水(shui)分(fen)子(zi)(zi)的結(jie)(jie)(jie)合(he)作用(yong)，使蛋白質(zhi)回復到水(shui)溶液狀態，從而脫(tuo)離固相載(zai)體(ti)。
洗滌(di)液中的(de)非離子型(xing)洗滌(di)劑一般(ban)是吐溫20，其濃度(du)可在0.05%～0.2%之間(jian)，高于0.2%時，可使包被在固相上的(de)抗原(yuan)或抗體(ti)解吸附而減低試驗的(de)靈敏度(du)。
流(liu)水(shui)(shui)沖洗(xi)法(fa)*初用于小珠(zhu)載體的洗(xi)滌，洗(xi)滌液僅為蒸餾水(shui)(shui)甚至可用自(zi)來水(shui)(shui)。洗(xi)滌時附接一特(te)殊裝置，使小珠(zhu)在流(liu)水(shui)(shui)沖擊下不斷地滾動(dong)淋洗(xi)，持續沖洗(xi)2分(fen)鐘后，吸干(gan)液體，再(zai)用蒸餾水(shui)(shui)浸泡(pao)2分(fen)鐘，吸干(gan)即可。浸泡(pao)式(shi)(shi)猶如盆浴，流(liu)水(shui)(shui)沖洗(xi)式(shi)(shi)則好(hao)比淋浴，其(qi)洗(xi)滌效果更為徹底，且也(ye)簡便(bian)、快速(su)。
已有實驗表明，流水沖洗(xi)式同(tong)樣也適用于微量滴定(ding)板的洗(xi)滌。洗(xi)滌時(shi)設法加(jia)大水流量或加(jia)大水壓，讓水流沖擊板孔表面(mian)，洗(xi)滌效果更(geng)佳。
洗板(ban)機洗板(ban)人為因素(su)少(shao)，速(su)度快，條件恒定，但是使(shi)用洗板(ban)機洗板(ban)時應注意以下三個關鍵點(dian)。
主(zhu)要(yao)的(de)參數是(shi)洗(xi)滌(di)量(liang)。自動(dong)洗(xi)板機會分(fen)配洗(xi)滌(di)液。如果你之前(qian)遭遇(yu)過高背景，那么不要(yao)猶豫，將(jiang)洗(xi)滌(di)量(liang)調為高，*好是(shi)比包被體積更高。太少(shao)的(de)洗(xi)滌(di)液會讓一(yi)部分(fen)分(fen)析表面洗(xi)滌(di)不到，從而明顯增(zeng)加背景。所有反應孔(kong)的(de)洗(xi)滌(di)量(liang)必(bi)須相同。
ELISA試(shi)劑(ji)盒的(de)(de)使用手(shou)冊(ce)中(zhong)列出(chu)包被量。我們建議(yi)使用350μl洗滌(di)液(ye)進行(xing)洗滌(di)，以便清(qing)潔整個反應孔(kong)的(de)(de)壁。一般來(lai)說，洗滌(di)量越高，則孵育步驟殘留的(de)(de)抗(kang)體(ti)或(huo)抗(kang)原量就越少。
影響洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)效果的(de)主要參數(shu)是洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)循環的(de)量。當(dang)然，洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)次(ci)數(shu)越多(duo)，背(bei)景越低。然而，太多(duo)次(ci)的(de)洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)會降(jiang)低信號強度(du)，使其難以測定(ding)。通常的(de)做法是在每(mei)次(ci)抗體或抗原孵育后重(zhong)復洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)三次(ci)。不過，一般而言(yan)，包被平板需要的(de)洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)次(ci)數(shu)比用戶包被的(de)平板要少。對于用戶包被的(de)ELISA板，必須優化洗(xi)(xi)滌(di)(di)(di)次(ci)數(shu)。
控制洗滌(di)(di)(di)量(liang)和洗滌(di)(di)(di)次數的(de)另(ling)一種(zhong)方法是(shi)加(jia)入過(guo)量(liang)的(de)洗滌(di)(di)(di)液(ye)。一般來說，96孔板的(de)每個孔能容(rong)納330至460 μl。不過(guo)，有些自動化洗板機可設置程序，分(fen)(fen)配遠遠超(chao)出這個量(liang)的(de)洗滌(di)(di)(di)液(ye)，比(bi)如(ru)1 ml。它是(shi)如(ru)何做到的(de)呢？其實很(hen)簡(jian)單，就是(shi)在(zai)分(fen)(fen)液(ye)的(de)同時(shi)打開(kai)吸液(ye)功能。換(huan)句話說，隨著分(fen)(fen)液(ye)器分(fen)(fen)配更多的(de)液(ye)體，抽吸器也將液(ye)體吸出。這種(zhong)技術(shu)能增(zeng)加(jia)洗滌(di)(di)(di)量(liang)，但不會(hui)溢出到其他孔中。
還有一(yi)些參數會影響洗滌步驟的效果。這(zhe)(zhe)些參數包括吸液高度和吸入(ru)位(wei)置(zhi)，這(zhe)(zhe)兩(liang)者都能調整，以降低(di)背景（殘留(liu)量(liang)）和差異。
殘(can)留液(ye)體(ti)中包含(han)未結(jie)合(he)的抗(kang)原(yuan)或抗(kang)體(ti)，它們會增(zeng)加背景信號。殘(can)留量越小，殘(can)留液(ye)體(ti)越少，轉移(yi)到下(xia)一步的干(gan)擾液(ye)體(ti)也就越少。
吸(xi)液(ye)高(gao)度會(hui)明顯影響(xiang)殘留(liu)(liu)量；如(ru)果洗滌吸(xi)頭(tou)與反應孔底部的距離(li)稍大，那就會(hui)讓殘留(liu)(liu)量急劇增(zeng)加。反之，如(ru)果洗滌吸(xi)頭(tou)壓著反應孔底部，那么也會(hui)使(shi)吸(xi)液(ye)效率(lv)降低，殘留(liu)(liu)量增(zeng)加。
目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸(xi)頭可在洗滌過程(cheng)中自由上下移動，而剛(gang)性洗頭則固定在適(shi)當的位置。使用剛(gang)性洗頭的洗滌操作在優化起來更(geng)為復雜，因(yin)為你需要非(fei)常仔細(xi)地(di)調(diao)整吸(xi)液高(gao)度(du)。如果你們實(shi)驗(yan)室使用幾(ji)種(zhong)不同的板，那可能會很耗(hao)時(shi)。在使用浮動洗頭時(shi)，吸(xi)頭會降到(dao)(dao)反(fan)應孔(kong)的底(di)部。調(diao)整高(gao)度(du)就不是很重(zhong)要，因(yin)此洗頭會下降到(dao)(dao)底(di)部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見，因為更快），那么抽吸的位置需要優化。*佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應孔(kong)的(de)中間(jian)，即(ji)使這是所有洗(xi)頭*常見(jian)的(de)默認位置。一般來(lai)說，*佳位置在孔(kong)中間(jian)與(yu)孔(kong)壁之間(jian)的(de)某處。
反(fan)應孔(kong)的形狀(zhuang)也會(hui)影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔(kong)板一般會(hui)比那些平底尖角的微孔(kong)板殘留量更低。
1.需每天校正注液(ye)量(liang)及殘液(ye)量(liang)，洗(xi)滌后殘液(ye)量(liang)不得大于(yu)2 μl。
2.及時(shi)更(geng)換(huan)破損吸液針，避免破壞底(di)板包被(bei)。
3.針對不同廠(chang)家酶標板注(zhu)意調整吸液頭下降高度，避免沖洗(xi)針頭卡(ka)住酶標板。
4.注意調(diao)整(zheng)洗(xi)液量，洗(xi)液量過(guo)多(duo)將(jiang)溢出，過(guo)少將(jiang)達(da)不到洗(xi)滌效果。
5.關機前使用蒸(zheng)餾水沖洗(xi)管道，避免(mian)洗(xi)液(ye)的結晶物堵(du)塞管道。
6.不同種試(shi)劑盒的(de)洗液嚴禁混合使用(yong)。
為(wei)了洗(xi)(xi)滌效(xiao)果較好，實(shi)(shi)(shi)驗室可(ke)采(cai)用機器(qi)與人工(gong)洗(xi)(xi)滌相結合的(de)(de)方(fang)法，在機器(qi)洗(xi)(xi)滌后再(zai)進行人工(gong)洗(xi)(xi)板1～2次，能達到理想的(de)(de)洗(xi)(xi)滌效(xiao)果。ELISA看(kan)起來很簡單，但(dan)是(shi)在實(shi)(shi)(shi)際操作(zuo)過程中，絕不能掉以輕(qing)心，除了嚴謹規范的(de)(de)實(shi)(shi)(shi)驗操作(zuo)，高品質的(de)(de)試(shi)劑盒與專業的(de)(de)技術(shu)團(tuan)隊(dui)也是(shi)獲得準確結果的(de)(de)保證(zheng)！
1.ELISA產品種類豐富：已上線3600種，有普通、高敏兩個系列，覆蓋15個研究領域；
2.樣本(ben)量少(shao)：人、大鼠樣本(ben)量需50uL，小鼠只需10uL；
3.操作時間短：*快2h完成孵育；
4.嚴(yan)格質控(kong)：精密(mi)度(du)（板間(jian)、板內(nei)變異(yi)系數）準確度(du)（回(hui)收率、稀釋線性）樣(yang)本值等8項質控(kong)指標檢測(ce)；
5.發表的(de)SCI文章數不勝數，*高影響因子可達15.84。